江西氯化钙供应商(江西氯化钙生产厂家)

作为我国古代文明的产物,在时代的发展中为我国留下了不计其数的蚕丝制品文物珍宝。丝蛋白是蚕丝纤维中的主要成分,很容易受到外界环境的影响产生变化,例如:光照、射线、微生物等等因素都会对其产生影响,导致蚕丝纤维被降解破坏。在地下墓葬中埋藏千年之后,蚕丝经历漫长的外部影响和分解,失去了原来的样子,蚕丝蛋白降解成多肽或氨基酸,或降解成微量,或降解成肉眼无法识别的土壤,这对我们获取更多的蚕丝文物去探索蚕丝的起源和进化历史造成了很大的阻碍。利用现代科学技术建立丝绸痕迹检测技术,让我们能够从印记、残留物和土壤提取物中分辨出古丝绸中的丝绸蛋白残留,这是丝绸考古研究的重大突破,有很重要的科学意义。由于真丝织物腐烂严重,出土后往往含有较多杂质,而且织物本身含量小,肉眼无法识别。在使用常规检测方法时,检测灵敏度低,会遇到杂质干扰等问题。此时,有必要探索新的检测方法来完成真丝织物的检测和鉴定。丝素蛋白鉴定技术方法是目前最有效的研究方法之一。

一、什么是丝素蛋白

丝素蛋白在蚕丝中产生,是天然的高分子纤维蛋白,在蚕丝中占据着70%的比例。丝素有着较高的理化和机械性能,其中有着18种氨基酸成分,柔韧性强、拉伸性、透气性、透湿性、缓释性比较强,在不同的处理方法下会有着不同的形态。丝素蛋白有着以下特征:第一,丝素蛋白有着较强的力学性能,这是其他天然纤维和高性能合成纤维达不到的特质。第二,丝素蛋白被广泛应用到外科领域之中,并且发展历史较长。第三,获取工艺简单,可通过多种方法获得膜或其他的形态。第四,对生物体不会造成危害,这也是丝素蛋白广泛运用到手术之中的原因

丝素蛋白作为一种天然纤维蛋白,一直以来都被人们所追捧。它有着柔软的触感,不仅可以做成衣服,穿着舒适,还可以起到护肤美容的作用。丝素蛋白被水解成一种小分子量的中间产物,称为多肽,可以穿透半透膜。完全水解后,形成丝氨基酸和丝肽。两者都是很好的化妆品添加剂。用于化妆品的丝素衍生物包括丝粉、丝肽和丝氨基酸。根据蚕丝的厚度、蚕丝肽的分子量和蚕丝氨基酸的状态,可分为10多个品种。化妆品中常用的品种有:蚕丝粉144、蚕丝粉400、蚕丝肽500、蚕丝肽1000和蚕丝氨基酸90。由于丝素蛋白和人类皮肤蛋白属于纤维蛋白,在结构上有许多相似之处,因此丝素蛋白及其水解物与人类皮肤有着天然的亲和力,有着其他任何蛋白质都不能比拟的作用。它不仅能够阻挡太阳光所带来的紫外线,对皮肤有保护的作用,还能利用其所蕴含的独特去油能力,通过丝粉发挥作用,增强皮肤与油性成分的亲和力。它是一款非常独特的防晒霜。

二、材料及方法

(一)材料

中国丝绸博物馆提供了两件战国时期楚墓出土的样品,每件重约1克。用质量浓度为5g/l的na和co处理蚕丝,在100℃、/次的条件下脱胶两次;接着使用去离子水清洗,在50℃下干燥,并在96℃水浴中用500g/l氯化钙溶液溶解。最终,冷却、过滤和干燥后,蚕茧丝在沸水中脱胶,脱胶溶液收集浓缩并冷冻干燥。

(二)丝素蛋白抗体的鉴定

直接法用于测定一级抗体的酶结合二级抗体浓度。制备的一级抗体用100μl/孔涂层稀释至8、4、2、1和0.1μg/ml的质量浓度,然后在4℃下涂于平板上过夜。各孔弃液,加入200μl清洗液,3分钟后倒入,重复3次,拍干,用倒置密封液封闭μl/100分钟,37℃培养1h,洗涤后加入酶标二抗,用屏蔽液稀释梯度。稀释梯度分别为800倍、1600倍、3200倍、5000倍和倍。每种一级抗体稀释和二级抗体稀释组合重复5个孔。37℃孵育1小时,100μl/孔洗涤,加入基质显色液,避光显色10分钟。在50μl/孔的条件下,加入停止溶液停止反应。

丝素蛋白抗原最佳包衣浓度的测定。采用间接法。用100μl/孔稀释丝素蛋白,质量浓度为8、4、2、1、0.500、0.250和0.125μg/ml,在平板上,在4℃下过夜。按照“1.3.1”中的说明关闭设备。洗涤后,加入封闭溶液的一级抗体梯度稀释液,稀释梯度分别为500倍、1000倍、2000倍、4000倍、倍、倍、倍、倍。将丝素蛋白涂层质量浓度和一次反稀释的每种组合重复5个孔。空白对照组用无一抗的封闭溶液代替抗体,阴性对照组用阴性血清代替。在37℃下培养1小时。洗涤100μl/孔,加入5000倍稀释的酶结合二抗,37℃孵育1h。用100μl/孔冲洗,加入底物显色液,避免光显色10分钟。加入停止液50μl/孔停止反应,立即用微孔板读数器测定d(450 nm)值。通过比较抗原和抗体的稀释比d(450 nm)≈1.0,选择了最佳的丝素包衣质量浓度和抗体的最佳稀释比。

抗体效价的测定。采用间接法。蚕丝蛋白的最佳包衣浓度为100μl/孔,在平板上重复包衣20孔,在4℃下包衣过夜。按照“1.3.1”中的说明关闭设备。洗涤后,加入封闭液梯度稀释的一抗,稀释梯度分别为500、1000、5000、、、、和次。阴性对照用阴性血清代替一抗。每次稀释重复2孔,细胞在37℃下培养1小时。二级抗体培养、底物着色和终止的过程与“1.3.1”中的相应步骤相同。

抗体的特异性测定。采用间接竞争法。在100μl/涂布板上测定完整抗原的合适浓度。按照“1.3.1”中的说明关闭设备。使用50μl/添加的竞争对手溶液以及50μl/i适当稀释抗体,竞争对手质量浓度梯度为106、105、104、103、102、10至1ng/ml。重复上述浓度5个孔。阳性对照组用封闭液代替竞争液,阴性对照组用阴性血清代替抗体i,其他条件与实验组相同。在37℃下培养1小时。二级抗体培养、底物显色和终止的过程与“1.3.2”相同。从每个竞争对手处获得的两个d(450 nm)值的平均值纳入通过以下公式计算的浓度抑制率:抑制率=100%-(竞争性孔d值-孔d值)/(正孔d值-负孔d值)×100%。以抑制率为y,丝胶标准溶液质量浓度的对数为x,绘制标准曲线,得到回归方程。当抑菌率为50%时,用回归方程计算丝胶的质量浓度(ic)。用同样的方法得到抑制率为50%的丝素浓度。将数据转换为计算交叉反应率的公式(丝的交叉反应率=质量浓度,抑制率为50%/丝胶的质量浓度抑制率为50%)×100%,以及丝胶与抗体之间的交叉反应率。

(三)土丝绸的定性鉴定

用砂浆粉碎两个天然丝样品,每个样品50mg,并与1ml氯化钙、水和乙醇混合物(摩尔比:1∶8∶2)混合。将样品置于55℃水浴中1小时,以 r/min离心5分钟。用移液枪移取1ml分子量为1kd的透析上清液膜,记录透析后溶液的体积。用移液枪将1ml透析液转移到离心管中,使用冷阱温度为-87℃,真空系统为1pa的冷冻干燥器浓缩条件,在-20℃下记录浓缩溶液的最终体积,并储存浓缩溶液。

样品中丝素蛋白的鉴定。采用间接法。丝素蛋白提取物以1的体积比用涂层稀释剂稀释∶100μl/孔,然后在4℃下在平板上过夜。用包覆的稀释剂代替空白孔,用丝素标准溶液代替阳性孔。按照“1.3.1”中的说明关闭设备。洗涤后,加入稀释度最好的抗体i,在阴性孔中用阴性血清替换抗体i。对每个样品重复5个孔。在37℃下培养1小时。二级抗体培养、底物着色和终止的过程与“1.3.1”中的相应步骤相同。1.5.1作为同一实验“1.3.4”的竞争对手,建立106、105、104、103、102、10至1ng/ml丝蛋白标准溶液的质量浓度标准曲线,并绘制丝素蛋白质量浓度与抑制率对数的标准曲线。由此我得到了回归方程。

样品的间接竞争。法检测以样品提取液作为竞争物进行和“1.3.4”相同的实验,得到的d(450 nm)值带入“1.3.4”中列出的抑制率计算公式,得到对应的抑制率后,利用标准曲线回归方程求出该抑制率下的丝素蛋白质量浓度。

三、出土丝织品样品中的丝素蛋白鉴定

(一)样品丝素蛋白提取液的获得

对抗体Ⅰ在古代丝织品中运用检测对丝素蛋白检测的结果进行评价,需要墓葬中的两份丝织品样品为测试材料。丝织品产生变色和老化现象的主要原因是蚕丝中的丝素蛋白酪氨酸和蛋白质晶体中其他的氨基酸成分成团。在实验的过程中,一般情况下需要对蚕丝中的丝素蛋白进行提取前,进行脱胶处理,再运用丝素蛋白溶解剂进行溶解。但在古代丝织品制作的过程中,对蚕丝已经进行了脱胶处理,所以,直接运用氯化钙、乙醇和水进行混合,再进行丝素蛋白样品的提取即可。通过溶解→离心→透析→冷冻→干燥等程序之后,取得了样品中的丝素蛋白提取液50 μl,可直接运用进行检测。将2份丝织品样品丝素蛋白的提取液分别标记为提取液Ⅰ和提取液Ⅱ。

(二)样品中的丝素蛋白检出

将两份样品的检测结果标注为提取液Ⅰ和提取液Ⅱ,通过的简介反应后得出结论,平均值在450 nm左右。设定与阴性对照的d(450 nm)值(用n表示)之比(pin)>2.1的结果为阳性。由此可得出结论,提取液i和Ⅱ的检测结果呈现均为阳性,在两份丝织品样品中,存在丝素蛋白。

四、结语

张琳琳 中国文物信息咨询中心

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